1.背景技術(shù)

2.專利內(nèi)容

3.發(fā)明意義

      本發(fā)明提供了一株新菌株——約克氏菌 （Yokenella sp.）WZY002，及其在區(qū)域選擇性還 原 α,β- 不飽和烯醛（酮）制備 α,β- 不飽和 烯醇和還原芳香醛（酮）制備芳香醇中的應(yīng)用。 該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址 ： 中國，武漢，武漢大學(xué)，430072，保藏編號 ：CCTCC  No:M2013099，保藏日期 ：2013 年 3 月 22 日。本發(fā) 明的有益效果主要體現(xiàn)在 ：提供了一株具有高區(qū) 域選擇性、高立體選擇性及高酶活力的新菌株，該 菌株催化 α,β- 不飽和烯醛（酮）的區(qū)域選擇性 還原可得到多種 α,β- 不飽和烯醇，同時該菌株 也能催化芳香醛（酮）的還原得到芳香醇。本發(fā)明 菌株作為生物催化劑，區(qū)域選擇性和立體選擇性 高，催化活性強，所催化的反應(yīng)不需要添加輔酶， 反應(yīng)條件溫和，在工業(yè)化生產(chǎn)上具有較高的應(yīng)用 價值。 

       本發(fā)明提供了一種烯醇脫氫酶及其編碼基 因，含有該編碼基因的載體、工程菌及其應(yīng)用。所 述烯醇脫氫酶的氨基酸序列如 SEQ ID No.1 所 示，其編碼基因如 SEQ ID No.2 所示。本發(fā)明提 供了一種來源于約克氏菌 WZY002（Yokenella  sp.WZY002）的烯醇脫氫酶基因核苷酸序列 ；該烯 醇脫氫酶基因可與表達(dá)載體連接構(gòu)建得到含該基 因的胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株 中，獲得重組大腸桿菌 ；該重組大腸桿菌經(jīng)細(xì)胞 破碎，分離純化獲得重組烯醇脫氫酶 ；該重組烯 醇脫氫酶具有還原烯醛、烯酮、芳香醛和芳香酮等 底物生成對應(yīng)的醇的能力 ；利用重組大腸桿菌或 重組烯醇脫氫酶為生物催化劑同時催化醇的氧化 和醛的還原，可以生成巴豆醛、苯甲醇、橙花醇和 香葉醇。

      本發(fā)明公開了一種酶法不對稱還原檸檬醛 提高(R )-香茅醛光學(xué)純度的方法，即氨基酸催化 的檸檬醛順反異構(gòu)反應(yīng)與釀酒酵母烯醇還原酶 OYE1催化的檸檬醛不對稱氫化反應(yīng)相偶聯(lián)，提高 檸檬醛氫化產(chǎn)物(R )-香茅醛光學(xué)純度的方法。所 述釀酒酵母烯醇還原酶OYE1催化檸檬醛順反異 構(gòu)體不對稱氫化合成(R )-香茅醛時，其(R )-香茅 醛源自反式檸檬醛，而(S)-香茅醛源自于順式檸 檬醛，并且對反式檸檬醛的催化速率要遠(yuǎn)高于順 式檸檬醛。通過偶聯(lián)氨基酸催化的檸檬醛順反異 構(gòu)反應(yīng)，將部分順式檸檬醛轉(zhuǎn)化為反式檸檬醛， 顯著地提高了產(chǎn)物(R )-香茅醛的e .e .值；在10mL 催化體系中，添加100mg/mL的甘氨酸，50mM檸檬 醛經(jīng)4h的催化反應(yīng)后，( R )-香茅醛的e .e .值達(dá) 65 .4％，與不偶聯(lián)順反異構(gòu)化反應(yīng)時(R )-香茅醛 的e .e .值(16 .7％ )相比，提高了48 .7％。

       本發(fā)明公開了一種老黃酶NemRPS突變體及 其在制備 (S) 香茅醇中的應(yīng)用，所述老黃酶 NemRPS突變體是將SEQ ID NO .2所示氨基酸序 列中第275位、第351位氨基酸進行單突變或雙突變獲得的。通過構(gòu)建共表達(dá)老黃酶NemRPS突變 體、醇脫氫酶YsADH和葡萄糖脫氫酶BmGDHM6的基 因工程菌，以該基因工程菌作為催化劑，以恒速流加方式加入底物，一鍋法多酶級聯(lián)催化底物(E/Z)檸檬醛的二步還原，產(chǎn)物(S)香茅醇累積 濃度達(dá)500mM，產(chǎn)物e .e .值>99％，反應(yīng)時間僅需12h，沒有中間產(chǎn)物和副產(chǎn)物殘留。